5月18日，Nature Methods雜志在線發(fā)表了題為“A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target effects”的研究論文，該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝研究組、中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所李亦學(xué)研究組和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉研究組合作完成。該研究根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)了脫氨酶ssDNA結(jié)合的重要氨基酸，在不影響催化活性的情況下，突變相應(yīng)的氨基酸（APOBEC1上的ssDNA結(jié)構(gòu)域相應(yīng)氨基酸），從而得到了顯著降低DNA脫靶的CBE突變體。
CRISPR/Cas9的衍生工具DNA單堿基編輯技術(shù)可以在不切斷DNA雙鏈的情況下實(shí)現(xiàn)單核苷酸的定向突變，為單堿基突變引起的遺傳性疾病的治療帶來了希望。因此自2016年首次報(bào)道以來受到了廣泛的關(guān)注。但是2019年，單堿基編輯工具的安全性風(fēng)險(xiǎn)受到了質(zhì)疑，先是楊輝等研究組（Zuo, E. et al, Science 2019; Jin, S. et al, Science 2019）報(bào)道了胞嘧啶單堿基編輯器存在嚴(yán)重的DNA脫靶，接著Keith Joung團(tuán)隊(duì)（Grunewald, J. et al, Nature 2019）、David Liu團(tuán)隊(duì)（Grünewald, J. et al, BioRxiv 2019）和楊輝團(tuán)隊(duì)（Zhou, C. et al, Nature 2019）5又分別報(bào)道了胞嘧啶單堿基編輯器和腺嘌呤單堿基編輯器存在大量的RNA脫靶效應(yīng)。雖然先前的研究中通過引入突變的方式顯著降低了RNA的脫靶，但是胞嘧啶單堿基編輯器的DNA脫靶依然沒有得到解決。
CBE的脫靶是由脫氨酶產(chǎn)生的。脫氨酶利用自身的ssDNA和RNA結(jié)合能力，攜帶Cas9蛋白在基因組或者轉(zhuǎn)錄組中隨機(jī)與ssDNA和RNA結(jié)合，并且利用自身催化活性將C突變?yōu)門，從而造成單堿基基因編輯工具基因組和轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)完全隨機(jī)無法預(yù)測(cè)的脫靶效應(yīng)。對(duì)此，研究者通過兩種方式試圖降低CBE的脫靶，第一種是在CBE的脫氨酶APOBEC1上引入突變，以此消除ssDNA和RNA的結(jié)合能力。他們一共構(gòu)建了23個(gè)CBE突變體，其中4個(gè)突變體不影響基因編輯效率檢測(cè)，而后通過DNA和RNA的脫靶檢測(cè)后獲得的3個(gè)突變體BE3R126E、BE3R132E和YE1-BE3能夠顯著降低DNA和RNA的脫靶SNV。該方法是通過突變APOBEC1上的核酸結(jié)合域關(guān)鍵位點(diǎn)，改變蛋白構(gòu)象，破壞結(jié)合能力，降低隨機(jī)脫靶。另外一種方式是利用來自于人的APOBEC3A蛋白替換APOBEC1蛋白，并在APOBEC3A的ssDNA結(jié)合位點(diǎn)引入突變，但是這種方式只能降低RNA的脫靶，而不能降低DNA上的脫靶。因此，本研究即以YE1-BE3為研究重點(diǎn)。為了進(jìn)一步提高YE1-BE3編輯效率，研究者隨后又在突變體基礎(chǔ)上增加標(biāo)簽和核定位序列（FNLS）。優(yōu)化后的單堿基編輯工具YE1-BE3-FNLS在保證高保真的情況下，顯著提高了基因編輯效率，從而成為既安全又高效的新的基因編輯工具。
該研究結(jié)果和David Liu團(tuán)隊(duì)今年2月10日發(fā)表在Nature Biotechnology的研究結(jié)論一致，兩篇文章都報(bào)道YE1在保持較高的編輯效率的同時(shí)降低了DNA和RNA上的脫靶，并且同時(shí)縮小了編輯窗口并降低了indel產(chǎn)生的比例。但是David Liu團(tuán)隊(duì)基于細(xì)菌抗性篩選的方法只適用于CBE，而楊輝團(tuán)隊(duì)基于GOTI的方法是不受限制的，不僅可以檢測(cè)單堿基編輯器，還可以用于其它基于融合蛋白的基因編輯工具的安全性檢測(cè)和改進(jìn)。在本研究中楊輝團(tuán)隊(duì)使用GOTI和RNA-Seq同時(shí)檢測(cè)了突變體的DNA脫靶和RNA脫靶，并且發(fā)現(xiàn)DNA和RNA的脫靶是互相獨(dú)立的，需要同時(shí)檢測(cè)。他們獲得的 YE1-BE3-FNLS是高精度、高活性單堿基編輯工具，顯著降低了脫靶效應(yīng)和提高了編輯效率，有望應(yīng)用于遺傳疾病基因治療，推動(dòng)基因編輯臨床化應(yīng)用。
該項(xiàng)工作由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉研究員，中科院分子細(xì)胞卓越創(chuàng)新中心孫怡迪博士，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所助理研究員袁堂龍，中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心賀冰冰和周昌陽博士等在中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝研究員, 中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所李亦學(xué)研究員和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉研究員指導(dǎo)下完成。（科技處）
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-0832-x
圖：經(jīng)典的BE3單堿基編輯工具APOBEC1脫氨酶具有ssDNA結(jié)合區(qū)域BD和催化活性區(qū)域AD（左側(cè)圖）。YE1-BE3-FNLS單堿基編輯工具APOBEC1脫氨酶丟失了ssDNA結(jié)合區(qū)域BD保留了催化活性區(qū)域AD（右側(cè)圖）。
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